Dai primi esperimenti al Nobel: l’optogenetica nel racconto di un neurofisiologo

Neuroni. Foto: Adobe Stock

“Nel 2009 andai a frequentare un corso pratico negli Stati Uniti. Un giorno una collaboratrice di Karl Deisseroth dell’Università di Stanford ci portò dei topi transgenici: alcuni dei loro neuroni producevano proteine derivate dalle alghe, che li rendevano sensibili alla luce. Cominciammo a eseguire degli esperimenti: illuminando la corteccia cerebrale, in particolare la corteccia motoria, era possibile attivare quei neuroni e indurre un movimento nell’animale. Era un esperimento che dimostrava in modo molto evidente le potenzialità di quel metodo e che, per me che lo osservavo direttamente, rappresentava un momento particolarmente significativo”. 

Quando Marco Mainardi – allora studente di dottorato alla Scuola Normale di Pisa e oggi neurofisiologo all’Università di Padova – si dedicava a quelle attività, lo sviluppo delle tecniche di optogenetica era ancora agli inizi. A distanza di quasi 20 anni, il nuovo metodo si è imposto in molti laboratori di ricerca e, proprio nei giorni scorsi, è valso il Nobel per la Fisiologia o la Medicina a Peter Hegemann, Georg Nagel e Karl Deisseroth, protagonisti a vario titolo della caratterizzazione delle proteine sensibili alla luce e della loro applicazione alla ricerca biomedica. 

Nel tempo l'optogenetica ha trasformato la ricerca di base sul cervello, e ha favorito nuove conoscenze su funzioni e disfunzioni cerebrali, aprendo in questo modo la strada anche a prospettive terapeutiche. Si stima che oggi siano più di 10.000 gli articoli scientifici che riportano scoperte rese possibili dall’impiego della nuova metodologia. Alcuni esempi riguardano lo studio della memoria, del processo decisionale e della comunicazione cuore-cervello. 

Il primo impiego clinico è stato tentato in un paziente con una patologia della retina, ottenendo un recupero parziale della percezione visiva, e attualmente sono in corso almeno quattro studi clinici in persone con disturbi visivi. C’è chi vede delle potenzialità anche nel trattamento di altri disturbi come il tremore essenziale, l’epilessia, la sordità, la sclerosi laterale amiotrofica, il dolore neuropatico. 

Oggi Marco Mainardi utilizza strumenti optogenetici nel suo laboratorio per studiare l’apprendimento e la memoria, anche in patologie in cui queste funzioni vengono compromesse. E porta questi temi nelle aule universitarie. Con lui abbiamo avuto una lunga conversazione. 

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Partiamo dall’inizio: quale ruolo hanno avuto Peter Hegemann, Georg Nagel e Karl Deisseroth nella nascita e nello sviluppo dell’optogenetica? 

Dei tre scienziati premiati con il Nobel, Peter Hegemann e Georg Nagel sono stati riconosciuti per la scoperta e la caratterizzazione delle channelrhodopsine, proteine identificate in alghe unicellulari sensibili alla luce (la Chlamydomonas reinhardtii, ndr). Questi organismi le utilizzano per rilevare la direzione della luce e orientarsi di conseguenza. La novità fondamentale è stata aver individuato in una specie addirittura unicellulare una proteina assente nei Mammiferi e aver compreso che questa poteva essere adattata per controllare l’attività dei neuroni. Infatti, le channelrodopsine si comportano come canali ionici attivati da luce di una specifica lunghezza d’onda e, quindi, possono essere sfruttate per controllare l’attività dei neuroni.

Il punto cruciale è proprio questo: il neurone, salvo alcune specifiche eccezioni, non è normalmente una cellula direttamente fotosensibile. Se invece introduciamo nel neurone il gene che contiene le istruzioni per produrre una di queste proteine – intuizione a cui giunse Karl Deisseroth –, possiamo renderlo sensibile alla luce.  In questo modo è possibile sia stimolare sia inibire l’attività neuronale. Questo rappresenta un cambiamento fondamentale rispetto agli approcci classici dell’elettrofisiologia. 

Quali potenzialità introduce l’optogenetica rispetto al passato?

Tradizionalmente prendevamo un elettrodo, lo inserivamo nel tessuto di interesse e applicavamo una corrente per stimolare i neuroni. L’inibizione di un neurone non era direttamente possibile per via elettrica e si doveva ricorrere a trattamenti farmacologici, non sempre specifici. L’approccio optogenetico consente invece di manipolare l’attività neuronale in entrambe le direzioni, eccitando oppure inibendo le cellule. Inoltre, poiché stiamo lavorando con una proteina geneticamente codificata, possiamo sfruttare tutti gli strumenti della biologia molecolare e dell’ingegneria genetica per decidere quali popolazioni cellulari debbano esprimere le opsine (la famiglia di proteine fotosensibili, ndr). Questo livello di selettività non era possibile con l’elettrostimolazione tradizionale.

Sono proprio queste caratteristiche degli strumenti optogenetici ad aver aperto la strada a migliaia di studi, che hanno permesso di identificare e studiare specifici circuiti sinaptici coinvolti in determinati comportamenti e funzioni cerebrali, dal comportamento sociale alla memoria, fino al dolore cronico. 

Le tecniche optogenetiche permettono di “accendere” o “spegnere” i neuroni come un interruttore. © The Nobel Committee for Physiology or Medicine. Ill. Mattias Karlén

L’optogenetica, dunque, si è rivelata cruciale nella ricerca di base…

È stata veramente una scoperta geniale, specie perché prende spunto da un fenomeno già presente in natura. Oggi abbiamo decine, se non centinaia, di proteine optogenetiche, ottenute attraverso mutagenesi e successive modificazioni delle proteine capostipiti identificate nelle alghe e in altri organismi unicellulari. Questo ci permette di manipolare l’attività dei neuroni con un grado di finezza molto elevato e anche di effettuare manipolazioni multiple su popolazioni neuronali diverse nello stesso sistema modello. Per il neuroscienziato di base è stata davvero una svolta fondamentale. 

La tecnica inoltre presenta anche importanti potenzialità terapeutiche e, in futuro, potrebbe consentire di affrontare alcune patologie caratterizzate da un alterato funzionamento dei circuiti neuronali. Le applicazioni teoriche sono numerose, anche se dovranno confrontarsi sia con i limiti intrinseci del metodo sia con la complessità delle condizioni cliniche umane, che non sempre riproducono fedelmente quanto osservato nei modelli preclinici. 

Anche in ambito clinico, dunque, si guarda all’impiego di tecniche optogenetiche. Attualmente con quali risultati?

Sono stati ottenuti dei risultati in alcune forme di perdita della vista. La retina contiene diversi tipi cellulari e, in alcune patologie, a degenerare sono i fotorecettori, cioè le cellule deputate a rilevare la luce e a convertirla in un segnale interpretabile dal sistema nervoso. Se i fotorecettori muoiono, l’occhio perde la capacità di vedere. Nella retina, tuttavia, rimangono altri tipi cellulari, tra cui le cellule gangliari, che danno origine al nervo ottico e trasmettono l’informazione visiva al resto del cervello.

L’idea che è stata sperimentata consiste nell’indurre l’espressione delle proteine optogenetiche direttamente nelle cellule gangliari. In questo modo, cellule che normalmente non sono fotosensibili – salvo alcune popolazioni molto specifiche – possono acquisire una sensibilità alla luce. La cellula gangliare può così assumere, almeno in parte, la funzione del fotorecettore perduto: diventa direttamente sensibile alla luce e può trasmettere nuovamente un’informazione visiva al cervello. In questo modo è stato possibile restituire all’animale e, in prospettiva, anche all’uomo, un certo grado di funzionalità visiva.

L’alga unicellulare Chlamydomonas si orienta verso la luce. © The Nobel Committee for Physiology or Medicine. Ill. Mattias Karlén

Lei ha parlato di patologie retiniche, ma alcuni studi suggeriscono anche altri ambiti di applicazione. A che punto è la sperimentazione?

La sperimentazione delle tecnologie optogenetiche in ambito clinico è ancora in una fase molto embrionale. Esistono evidenze estremamente promettenti provenienti dai modelli preclinici, soprattutto nei roditori, e sono stati condotti anche alcuni studi nei primati. Tuttavia, il passaggio all’uomo presenta ancora numerose difficoltà. 

Un esempio, oltre a quello delle patologie retiniche, riguarda l’epilessia. Sempre in un modello preclinico di epilessia, i neuroni coinvolti nelle crisi erano stati modificati in modo da esprimere una proteina optogenetica inibitoria. L’area cerebrale dalla quale originavano le crisi epilettiche nei topi veniva monitorata attraverso elettrodi, una procedura che, in determinate circostanze, viene utilizzata anche nei pazienti.

L’elettrodo registrava l’attività neuronale e la trasmetteva a una sorta di microcomputer, che riconosceva l’insorgenza di una crisi epilettica e inviava un comando luminoso. Questo attivava l’opsina inibitoria e permetteva di ridurre immediatamente l’attività neuronale all’origine della crisi. Si tratta di un’applicazione potenzialmente molto interessante, perché l’epilessia è una patologia neurologica non sempre di facile gestione.

Tra i suoi interessi di ricerca figurano studi su patologie che compromettono le funzioni cognitive. Qual è il contributo dell’optogenetica in questo campo? 

Io sono neurofisiologo e ho utilizzato, e utilizzo, strumenti optogenetici per lo studio dell’apprendimento e della memoria, comprese le patologie nelle quali queste funzioni sono compromesse, come la malattia di Alzheimer. Ho condotto anche altri tipi di esperimenti che hanno sfruttato questa tecnologia, collaborando a studi sulla maniera in cui i tumori cerebrali si integrano nel tessuto sano e perturbano l’attività dei circuiti sinaptici. 

Anche in questo settore esistono potenzialità terapeutiche. Nei sistemi preclinici, in particolare nei topi, è stato dimostrato che l’optogenetica può essere utilizzata per stimolare i neuroni coinvolti nell’immagazzinamento di determinati tipi di memoria. Una stimolazione particolarmente intensa attraverso la luce può consentire di riportare alla luce memorie che risultavano compromesse. Ma, lo ripeto, si tratta di risultati ottenuti in laboratorio. Gli animali vengono sottoposti a compiti di apprendimento e memoria che sono molto meno complessi e raffinati rispetto a quelli che caratterizzano le capacità cognitive umane. 

Se dovessi esprimere un mio parere personale, vedo relativamente più facile, pur trattandosi comunque di un obiettivo difficile, controllare l’attività di un nucleo di neuroni coinvolti nell’epilessia piuttosto che ripristinare le funzioni di memoria in un paziente con Alzheimer. Quest’ultimo obiettivo mi sembra estremamente complesso, perché richiede un grado di finezza molto elevato.

Karl Deisseroth ha introdotto il gene che codifica per la channelrhodopsina-2 nelle cellule nervose. © The Nobel Committee for Physiology or Medicine. Ill. Mattias Karlén

Accanto alle enormi potenzialità, lei accennava prima anche ai limiti intrinseci delle tecniche optogenetiche. Quali sono?

La tecnologia in sé è sensazionale e tutti noi che lavoriamo nel campo delle neuroscienze ne abbiamo ormai pienamente apprezzato le potenzialità. Per il trasferimento all’uomo, però, ci sono almeno un paio di limiti concreti.

Il primo riguarda la modalità con cui si fanno esprimere queste proteine ai neuroni che ci interessano. È possibile farlo, ma si tratta di manipolazioni relativamente semplici da eseguire in un animale da laboratorio, ma molto più complesse e invasive quando si parla di cervello umano.

Il cervello, infatti, non è accessibile come può esserlo, per esempio, una vena nella quale si inietta un farmaco. Esiste quindi il problema di effettuare procedure potenzialmente invasive per somministrare ai neuroni di interesse i cosiddetti vettori, che consentono di introdurre il materiale genetico necessario all’espressione delle proteine optogenetiche. 

Si riferisce ai vettori virali, per esempio?

Sì. I vettori che utilizziamo tipicamente sono vettori virali, e il loro impiego non è affatto banale. I vettori hanno inoltre una capacità limitata: la quantità di materiale genetico che possono trasportare non è infinita. Ci sono quindi numerosi aspetti tecnici di cui tenere conto.

Ma c’è anche un problema pratico: questi vettori devono essere somministrati nel punto corretto. Se voglio intervenire su una popolazione specifica di neuroni, devo raggiungerla con precisione. Questo può anche significare aprire il cranio, entrare nel cervello, raggiungere i neuroni di interesse ed effettuare un’iniezione predisposta in modo da ottenere un’elevata efficienza di trasferimento. E non è detto che tutti i neuroni che ci interessano acquisiscano il vettore.

A questo si aggiunge il problema di rendere questi neuroni controllabili attraverso la luce. Se si tratta di neuroni superficiali, per esempio nella corteccia, l’invasività può essere relativamente ridotta. Se invece vogliamo raggiungere una struttura cerebrale profonda, dobbiamo impiantare una fibra ottica che consenta di portare la luce fino alla regione interessata. Naturalmente, interventi di questo tipo non sono impossibili. Quando nei pazienti con malattia di Parkinson vengono impiantati elettrodi per la stimolazione cerebrale profonda, si esegue, per grandi linee, una procedura che presenta alcune analogie. Non sono un clinico, quindi non posso esprimere un giudizio specifico sul rapporto rischio-beneficio di queste procedure, ma è evidente che, in questo contesto, tale rapporto diventa estremamente rilevante.

Quali sono i prossimi passi?

Per quanto riguarda l’utilizzo clinico, credo sia opportuno concentrarsi sul trattamento di patologie in cui è relativamente semplice sia ottenere l’espressione delle proteine optogenetiche sia stimolarle attraverso la luce. Da questo punto di vista, la retina e la pelle rappresentano bersagli relativamente accessibili. 

Allo stesso tempo, una volta completati gli studi preclinici necessari, sarà importante perfezionare le strategie chirurgiche per l’espressione delle proteine e per il posizionamento delle fibre ottiche. Questo potrebbe permettere, in prospettiva, di affrontare anche strutture cerebrali profonde. L’occhio ed, eventualmente, strutture cerebrali relativamente superficiali, come la corteccia cerebrale, potrebbero quindi essere bersagli più facilmente accessibili rispetto a strutture profonde, come l’ippocampo o i gangli della base. Ma non è impossibile raggiungere nemmeno queste: è semplicemente necessario svolgere ancora molto lavoro, prima a livello preclinico e poi nell’ottimizzazione delle procedure cliniche.